脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种（zhǒng）常染色体隐性遗传病，居（jū）儿童致（zhì）死性常染色体隐性遗传病的第2位。位于染（rǎn）色体5q11.2～q13.3上的运动（dòng）神经元存活基因（yīn）（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主（zhǔ）要致病基因。

　　人基因组有（yǒu）两个紧邻的高度同源（yuán）的SMN基因：端粒侧的SMN1和着（zhe）丝粒侧的SMN2，两者仅有5个碱基不同（tóng）。SMN1是主要功能基因（yīn），该基因突（tū）变可导致（zhì）SMA发病，SMN2为临床表型的调节（jiē）基因，影（yǐng）响病（bìng）情的严重程度（dù），其拷贝数增加可减轻SMA表型。目前已知约94％的SMA患（huàn）者为SMN1基因第7和（或）第8外显子（zǐ）纯合（hé）缺失所（suǒ）致，少数病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起（qǐ）。

　　SMN1基因外显子缺失检测的意（yì）义

　　SMA在人群中的发（fā）病（bìng）率为1/5000～1/10000，群体（tǐ）携带者（zhě）频率（lǜ）为（wéi）1/35～1/50，是出生缺陷（xiàn）的（de）高（gāo）危因（yīn）素，因此极有必（bì）要进行SMA携带者的人群筛查，并通过产前诊（zhěn）断技（jì）术降（jiàng）低（dī）人群中SMA患儿的出生（shēng）率（lǜ）。

　　临（lín）床上将（jiāng）SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中（zhōng）间（jiān）型和少年型，严重程度依次递减（jiǎn）。神（shén）经专科医生一般根（gēn）据患者发（fā）病（bìng）年龄（líng）、临床表（biǎo）现（xiàn）及病情进展程（chéng）度（dù）进行临床诊断（duàn），辅助检查方法包括（kuò）肌电图、肌（jī）酶和肌肉活检，结（jié）合（hé）家族史和SMN1基因分析可进行确诊。由（yóu）于SMA患（huàn）儿中（zhōng）约（yuē）94%为SMN1基（jī）因外显子纯合（hé）缺失，因此，SMN1基因缺失检（jiǎn）测对于SMA的诊断具（jù）有更（gèng）高的灵敏度（dù）和特异性。且对不（bú）同型的（de）SMA患者，SMN1纯合缺失率没有（yǒu）显著差（chà）异，所以，SMN1纯合缺失的检测对于（yú）不（bú）同型（xíng）SMA患者具有相同的（de）临床诊断价值（zhí）。在欧美人群中，SMN1基因纯合缺失（shī）检测已成为诊（zhěn）断和（hé）排除诊断（duàn）SMA的首（shǒu）选方法（fǎ）。

　　SMN1基因缺失检测试（shì）剂的（de）现（xiàn）状

　　目（mù）前，SMN1基因外显子缺失检测试（shì）剂较为缺（quē）乏，临床检验实验室较为公（gōng）认的方法（fǎ）是PCR结合限制（zhì）性片段长度多（duō）态性（PCR-RFLP）的（de）方法。但该（gāi）方（fāng）法操作较为繁琐（suǒ），且重（chóng）复性差，不利于（yú）标准化，不易推广。同时，这种方（fāng）法只能检测出纯合缺（quē）失，无法确认杂合缺失。

　　荷（hé）兰的SMAMLPA检测试剂可对待测（cè）靶序列（liè）进行半定量分析，因此（cǐ）既可检测纯合缺失，亦可确认杂合缺失。在（zài）国（guó）内外已有多篇文献（xiàn）报道采（cǎi）用该方法进行（háng）SMA患者诊断（duàn）和SMA携带者筛查。但该产（chǎn）品（pǐn）目前仍（réng）为（wéi）“仅用（yòng）于研究”的试剂，尚（shàng）未按照体（tǐ）外诊断类医疗器械（xiè）上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国（guó）家食品药品监管总（zǒng）局批准了第一项（xiàng）SMN1缺失突变检（jiǎn）测试剂上市。该产（chǎn）品采用多重实（shí）时荧（yíng）光MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因（yīn）组单拷贝基因RPP40为内参（cān）基因，对SMN1基因（yīn）第7外显（xiǎn）子和第8外显子拷贝（bèi）数进行相对（duì）定（dìng）量检测（cè），用（yòng）于SMA患者的体外辅助分子诊（zhěn）断（duàn）。SMN1基因外显子缺失检（jiǎn）测的难点之一在（zài）于排除高同源性基因SMN2的干扰，特别是对于（yú）SMN2高拷贝数（shù）的受试者（zhě），需保证结果的准确可靠。该产品通过对实时荧光PCR相对定（dìng）量、绝对定（dìng）量技术进行系统整（zhěng）合，并在反应体系中加入特（tè）定化学组分，以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配，增加PCR扩增的特异（yì）性（xìng），从而有效（xiào）控制SMN2基因非特异性（xìng）扩增对检测结果的影（yǐng）响，准确检（jiǎn）出高拷贝（bèi）数（shù）SMN2样本中SMN1基因第7和第（dì）8外显子的缺失情况（kuàng）。

　　鉴于国内外尚（shàng）无任何按照体外诊断（duàn）试剂（jì）批准上市的SMA分子诊断产品，因此临床试验方案中依据EMQN关于（yú）《SMA分子诊（zhěn）断最佳实践指南》，采用了国内外SMA体外辅助分子（zǐ）诊断领域公认（rèn）的（de）PCR-RFLP法（fǎ）作为（wéi）对照方（fāng）法。临（lín）床试（shì）验共完成1069例（lì），其中正（zhèng）常（cháng）对照组（zǔ）777例，SMA病例组292例，统计（jì）分析结果显示申（shēn）报产品与对比方法检测结果（guǒ）的一致（zhì）性为100%（95%置信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成（chéng）年人大（dà）样本中目（mù）标外（wài）显子△△Ct分布（bù）范围的调（diào）查亦显（xiǎn）示，该产品的（de）纯合突变判（pàn）断界值设置（zhì）合理。

　　该试剂目前批准的预期用途仅包含（hán）纯（chún）合缺（quē）失的检测，尚不能用于杂（zá）合缺失的检测，因（yīn）此（cǐ）无法用于SMA携带者的筛查（chá），这是该产品的缺（quē）陷之一。

　　事实上，该产品（pǐn）在设计上已考虑到SMA携带（dài）者的检测，其检测原理是（shì）以待（dài）测样本中目标（biāo）外显子荧光信号Ct值（zhí）与内参基因（yīn）荧光信号Ct值之差（chà）（△Ct_s），与正常对（duì）照品三（sān）个梯度稀释品（pǐn）中（zhōng）目标外显子荧光信号Ct值（zhí）和内参基（jī）因（yīn）荧光信号Ct值之差的平均值（△Ct_a）之差（chà），即△△Ct，作为待测样本中（zhōng）目标外显子（zǐ）拷贝数检（jiǎn）测变（biàn）量（liàng）（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧光定量（liàng）PCR相对定量的基本数学原理推导得到（dào）申报产品检测变量△△Ct的计算（suàn）公式，依据这一计算（suàn）公式可（kě）推导出纯（chún）合缺失（shī）、杂合缺失和野生型（xíng）的△△Ct理论值（或范围）；再结（jié）合目标外显子与内参基因扩增效率差异以及SMN2不同拷贝数的影（yǐng）响，可对上述△△Ct理（lǐ）论（lùn）值进行优化。结果显示纯合缺失、杂合缺失和（hé）野生型（xíng）的△△Ct值（或（huò）范围）之间可设置合理的判断（duàn）界值，因此（cǐ）理论上该产品可分别检测出三种基因（yīn）状态（tài）。但（dàn）鉴于（yú）生产企业对杂合缺失与野生型之间的判（pàn）断界（jiè）值研究尚不透彻，再加（jiā）上缺（quē）乏可判定杂（zá）合缺失的对比方法等（děng）其他困（kùn）难，本次（cì）注册申请（qǐng）的预期用途仅限于检测纯合突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综（zōng）上（shàng），SMN1基因（yīn）外显（xiǎn）子缺失检测（cè）在SMA疾病诊断和SMA携（xié）带（dài）者筛查中具有重要的临床价值。然而到目前为止，受到技术水平的限制，相关的体外诊断试剂比较缺乏，特别是（shì）可用于SMA携带者筛查的杂合缺（quē）失检测，尚（shàng）无（wú）适合的体外诊断试剂上市。（器（qì）审中心审评六部  何静云）

来源：中国（guó）医药报